Identificación de Microorganismos antagonistas del HONGO Fusarium sp. en órganos de Heliconia spp. Antagonists’ microorganisms of Fusarium sp. in organs of Heliconia spp.

RESUMEN

Se identificó el comportamiento de microorganismos antagonistas del hongo Fusarium sp., un patógeno de los tallos, las raíces, las inflorescencias y las hojas de Heliconia sp, con el propósito de encontrar alternativas para el control de enfermedades ocasionadas por éste. Se evaluó la actividad antagónica frente a Fusarium sp. aislando cinco hongos encontrados en distintos órganos del cultivo de Heliconia sp., se almacenaron en bolsas herméticas y se conservaron a baja temperatura hasta el momento de procesarlas en el laboratorio. La actividad antagónica entre las morfoespecies de Alternaria sp., Aspergillus sp. (1 y 2), Nigrospora sp. (1 y 2), Papulospora sp., y Trichoderma sp. (1 y 2) frente a las seis subespecies de Fusarium sp. fue mayor, especialmente después de 168 horas de crecimiento. En algunos casos el diámetro promedio de los antagonistas invadió el área micelial del Fusarium sp. Se encontró que algunos hongos presentes en diferentes partes de la planta actúan como antagónicos (Alternaria sp., Aspergillus sp. Nigrospora sp., Papulospora sp. y Trichoderma sp) y contribuyen a reducir la severidad de ataque de otros fitopatógenos más agresivos, demostrando así su potencial como agentes antagónicos de Fusarium sp.

PALABRAS CLAVE

Hongos, Fusarium sp., antagonismo, microorganismos

ABSTRACT

Studies on the behaviour of Fusarium sp., microorganisms antagonists pathogenic of stems, roots, inflorescence and leaves of Heliconia sp, was realized, with the purpose to find alternatives for control of illnesses caused by this organism. The activity antagónistic front to Fusarium sp., isolating five funguses found in Heliconia sp. crop was evaluated and stored in hermetical bags and preserved in cold. The activity antagónistic between the species of Alternaria sp., Aspergillus sp. (1 And 2), Nigrospora sp. (1 And 2), Papulospora sp., and Trichoderma sp. (1 And 2) front to the six subespecies of Fusarium sp., was main, especially after 168 hours of growth. In some cases the diameter average of the antagonistics has grown on Fusarium sp micelial area. Found that some present funguses in different organs of the plant act like antagónistic (Alternaria sp., Aspergillus sp. Nigrospora sp., Papulospora sp. and Trichoderma sp), and contribute to reduce the severity of attack of other fitopatógenos more aggressive, showing like this, his potential like agents antagónistic of Fusarium sp.

KEY WORDS

Funguses, Fusarium sp., antagonism, microorganisms.

1. INTRODUCCIÓN

En la actualidad existe una demanda internacional creciente de producción de flores exóticas. En Colombia el primer lugar en la exportación de flores lo representa el grupo de rosas, clavel y crisantemos con el 68,3% ; el 31,7% restante está conformado por las flores tropicales , donde están incluidas las heliconias (PROEXPORT, 2008). Este renglón económico está expuesto al ataque de enemigos naturales (hongos, virus, bacterias o insectos), que inciden en su productividad. El incremento de áreas cultivadas con heliconias, potencia el desarrollo de problemas fitosanitarios (Kress et al., 1993). En cultivos comerciales las medidas de control se basan en el uso de agroquímicos, práctica que lentamente está variando a la implementación de controles biológicos con el propósito de proteger y mitigar el impacto sobre los ecosistemas. Para implementar estas alternativas es necesario conocer la biología de los organismos que interactúan en los cultivos (Agrios, 2005).

En el control biológico de fitopatógenos, los organismos antagonistas juegan un papel muy importante por presentar características de agresividad, persistencia, rápido crecimiento, desarrollo y capacidad de colonizar el medio donde se encuentra el agente causal de la enfermedad, aun en condiciones de “stress” nutricional (Saldarriaga y Pineda, 2001). Tales características se presentan en la especie del género Fusarium sp.

El antagonismo como mecanismo se basa en la activad inhibitoria directa que ejerce un microorganismo sobre otro y que presenta acciones opuestas en un mismo sistema (Cotes, 1993). En la micro-biota del suelo existe una gran variedad de microorganismos que ejercen actividad antagónica contra patógenos de plantas, manteniendo de esta manera un equilibrio natural (Trapero, 2000). Se conocen algunos organismos que afectan las plantaciones de Heliconia, entre ellos: Alternaria, Fusarium oxysporum, Drechslera musae-sapientum, Phyllosticta musae, Glomerella cingulata, Gloeosporium musarum, Colletotrichum musae, Guignardia musas, Curvularia sp, Mycosphaerella musicola y Pestalotia sp. Es necesario desarrollar técnicas alternativas de control biológico, basadas en la identificación de las características de diversas especies de hongos, con el fin de sustituir o disminuir el uso de productos químicos (Madriz et al., 1991).

En la rizósfera se presenta una competencia continua por espacio y alimento entre los microorganismos que la habitan. Ciertas especies de Trichoderma tienen un potencial antagónico debido a su potencial para producir compuestos anti-fúngicos, enzimas extracelulares y sustancias antibióticas (Harman et al., 1996). También a la capacidad de luchar por espacio y nutrientes frente a otros hongos. Fuera de estas características, es un agente promotor del crecimiento de las plantas e inductor de la resistencia sistémica (Hermosa et al., 2000).

Trichoderma es un organismo saprofito natural del suelo, lo cual le proporciona ventajas, tales como antibiosis, competencia por nutrientes, espacio y micoparasitismo, mecanismos que actúan coordinadamente. Su importancia en el proceso de bio-control depende de la cepa de Trichoderma empleada, el hongo que se requiere controlar, el tipo de planta o cultivo y algunas condiciones ambientales, como pH, disponibilidad de nutrientes, humedad relativa, temperatura y concentración de hierro (Benítez et al., 2004).

Entre los fitopatógenos que puede controlar Trichoderma sp., se encuentran Fusarium oxysporum, Phytophthora nicotianae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora capsici, Phytophthora Cactorum, Rhyzoctonia solani, Pythium sp., Sclerotinia sclerotiorum, Colletotricum gloesporioides, Sclerotium rolfsii, Rosellinia bunodes, Botrytis cinerea Armillaria mellea, Phytium sp. y Cryptonectria parasítica (Cole Zyenyika, 1988).

Trichoderma sp. tiene la capacidad de colonizar y adaptarse a diferentes clases de sustratos en condiciones controladas, generando como resultado una limitación del crecimiento de los organismos (Borrero y Silva, 2005). Los estudios para controlar el fitopatógeno Fusarium oxysporum en cultivares de tomate empleando Trichoderma sp. presentan porcentajes de preemergencia de semillas equivalentes al 66,9% (Betancourt y Kress, 1993), demostrando su capacidad protectora. Se han reportado porcentajes de control de Rhizoctonia solani y F. oxysporum sp. en cultivos de tomate de 68% y 70 %, respectivamente, usando controladores biológicos como Trichoderma sp. (Cárdenas, 1999). Estas consecuencias indican la eficacia de usar agentes antagónicos como control biológico.

Algunas especies son cosmopolitas y se pueden encontrar en materia orgánica en descomposición o son patógenas de cereales, plantas ornamentales, frutas y hortalizas. Otros géneros como Alternaria sp., Drechslera sp. y Nigrospora sp. son especies distribuidas en el suelo asociadas al detrimento de plantas y semillas y obtienen los nutrientes necesarios para su desarrollo del material descompuesto. En ocasiones, debido al mal manejo de los residuos vegetales en los cultivares los hongos pasan fácilmente del suelo a las plantas, por lo que resulta frecuente su presencia en el follaje de estas (Barnett y Hunter, 1972).

Existen otros patógenos que inciden sobre el follaje, como Collectotrichum sp., que afecta las brácteas cuando las plantas presentan déficit nutricional. También se han encontrado patógenos en el suelo, como Pytium sp, Phythopthora sp y Rhizoctonia sp, que afectan las raíces y tallos (Escalona et al., 1992).

Fusarium oxysporum es, predominantemente, un saprofito abundante y activo del suelo y de la materia orgánica. Algunas de sus cepas tienen una actividad patogénica específica, pero constituyen una proporción muy reducida de la población total del suelo aunque causan enfermedades importantes en los cultivos. Algunas se encuentran poco especializadas y causan muerte de plántulas, necrosis o podredumbres (Smith, 1992). Actualmente hay descritas unas 80 patotipos y varias de éstas se subdividen en biotipos (Armstrong y Armstrong, 1981).

2. MATERIALES Y MÉTODOS

Debido a sus características saprófitas, su actividad en el suelo y la materia orgánica, se seleccionó como objeto de estudio el hongo Fusarium oxysporum obtenido de muestras colectadas del material vegetal con síntomas de enfermedad, que fueron lavadas con agua destilada y cortadas en trozos de aproximadamente 10 x10 mm y posteriormente colocadas en hipoclorito de sodio al 0,5% por 30 segundos. Posteriormente, se enjuagaron con agua destilada estéril (ADE), procedimiento que se repitió 3 veces. Se dejaron secar sobre papel adsorbente estéril y se sembraron en un medio de cultivo de agar nutritivo (AN).

Para evaluar la actividad antagónica frente a Fusarium sp., se escogieron cinco tipos de hongos que habían sido aislados por Martínez (2008) del tejido de plantas de Heliconia (Tabla 1), cultivadas en el Parque Nacional de las Heliconias de Caicedonia (4° 19’ 25’’ N y 75°15’ W), clasificado como bosque húmedo subtropical (bh-ST) de acuerdo con la clasificación de Holdridge. Estas cepas están conservadas en la Micoteca del Laboratorio de Fitopatología de la Universidad del Valle. Los hongos seleccionados fueron: Trichoderma sp. (morfoespecie 1 y 2), Aspergillus sp. (morfoespecie 1 y 2), Nigrospora sp. (morfoespecie 1 y 2), Papulospora sp, Alternaria sp. y Drechsiera sp.

Tabla 1. Presencia de hongos en los órganos evaluados en el cultivar del Parque Nacional de las Heliconias

Después de la incubación de cada hongo, se realizaron observaciones macroscópicas y microscópicas para clasificar las colonias por el tipo de micelio y sus características. También se observaron sus estructuras reproductivas, para validar la determinación de los géneros.

Con el fin de preservar muestras viables de los hongos aislados del follaje de heliconias por Martínez (2008) se replicaron cultivos puros de cada patógeno en medio de cultivo PDA. Cuando los hongos alcanzaron un tamaño entre 5 y 7 cm de diámetro de la colonia se tomaron 10 muestras de aproximadamente 1 cm2 y se depositaron en tubos de ensayo de 50 ml, previamente esterilizados, que contenían, cada uno 38 ml de ADE. De cada hongo se realizaron dos réplicas (dos tubos de ensayo por hongo), creando así una micoteca adicional.

Los hongos aislados del follaje y los obtenidos de la micoteca sobre el patógeno seleccionado (fusarium sp.) se sembraron en PDA dentro de cajas Petri. Las muestras se expusieron a una temperatura de 27ºC, realizando observaciones a las 24, 48, 58, 72, 82, 120, 144 y 168 horas, con el fin de evaluar su desarrollo y comportamiento. Se llevaron a cabo pruebas de tipo cualitativo, tomando muestras del área de contacto entre los organismos y del área del organismo que está siendo afectado por la invasión del otro. El mismo procedimiento se realizó para Fusarium oxysporum, midiendo periódicamente el diámetro del área micelial con un pie de rey. Los cultivos puros de las seis morfoespecies de Fusarium mostraron características típicas de cepas pertenecientes a la especie Fusarium, oxysporum. Estudios realizados por Smith (1992) demuestran que las colonias de F. oxysporum producidas en medio APD tienen un aspecto variable que depende de la cepa; en general, el micelio de ésta, en su primera etapa de desarrollo, es blanco, pero a medida que va creciendo cambia su color a distintos tonos, desde violeta a morado oscuro y si abundan los esporodoquios las colonias pueden aparecer crema o naranja. El medio de cultivo se tiñe de igual color que la cepa.

Para medir el grado de antagonismo, se construyó una escala que calificaba la invasión del antagonista (Tabla 2), basada en la escala utilizada por Correa y Peñuela (2002).

Tabla 2. Escala para medir el grado de invasión del Organismo antagónico

Se realizó la prueba de Kolmogorov–Smirnov para determinar si los datos presentaban distribución normal, empleando el programa PAST versión 1.8 (Hammer et al., 2001). Los datos con distribución normal se analizaron con la prueba t student. En los casos que no presentaron distribución normal se utilizó el test paramétrico de Mann–Whitney, empleando el programa PAST versión 1.8 (Hammer et al., 2001). Se trabajo con un nivel de confianza del 95%.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Con excepción de Drechsiera sp., todos los demás hongos aislados (Trichoderma sp. - morfoespecie 1 y 2, Aspergillus sp. - morfoespecie 1 y 2, Nigrospora sp. - morfoespecie 1 y 2, Papulospora sp. y Alternaria sp.) generaron actividad inhibitoria en Fusarium sp.

Las Figuras 1 al 8 muestran la actividad antagónica entre las morfoespecies de Alternaria sp., Aspergillus sp. (1 y 2), Nigrospora sp. (1 y 2), Papulospora sp. y Trichoderma sp (1 y 2), frente a las seis subespecies de Fusarium sp. Se observa que a partir de las 72 horas el promedio de los diámetros de los hongos fue mayor que el del patógeno. Después de las 168 horas las diferencias se incrementaron y, en algunos casos, el diámetro promedio de los antagonistas invadió el área micelial del Fusarium sp.

El análisis estadístico realizado entre los hongos patógenos aislados del follaje de heliconias (Alternaria sp., Papulospora sp., morfoespecies 1 y 2 de Trichoderma sp. y morfoespecies 1 y 2 de Nigrospora sp.) frente a las seis morfoespecies de Fusarium sp. no mostró diferencias significativas en la actividad antagónica. Sin embargo, las pruebas biológicas señalaron un mayor crecimiento del área micelial de los antagonistas frente a las cepas de Fusarium sp. desde las primeras 24 horas. Pasadas 72 horas las diferencias fueron más evidentes.

Los tratamientos que enfrentaron las morfoespecies 1 y 2 de Aspergillus sp. con las seis morfoespecies de Fusarium sp. presentaron diferencias significativas en la actividad antagónica entre la morfoespecie 1 de Aspergillus sp. y las morfoespecies 2, 4 y 6 de Fusarium

Figura 1. Tratamiento entre Alternaria sp, vs seis morfoespecies de Fusarium sp.

Figura 2. Tratamiento entre la morfoespecie 1 de Aspergillus spp, vs seis morfoespecies de Fusarium sp.

Figura 3. Tratamiento entre la morfoespecie 2 de Aspergillus spp, vs seis morfoespecies de Fusarium sp.

Figura 4. Tratamiento entre la morfoespecie 1 de Nigrospora spp, vs seis morfoespecies de Fusarium sp.

Figura 5. Tratamiento entre la morfoespecie 2 de Nigrospora spp, vs seis morfoespecies de Fusarium sp.

Figura 6. Tratamiento entre Papulospora sp, vs seis morfoespecies de Fusarium sp.

Figura 7. Tratamiento entre la morfoespecie 1 de Trichoderma spp, vs seis morfoespecies de Fusarium sp.

Figura 8. Tratamiento entre la morfoespecie 2 de Trichoderma spp, vs seis morfoespecies de Fusarium sp.

Tabla 3. Niveles de antagonismo sobre las morfoespecies de Fusarium sp. después de 336 horas.

sp. El mismo resultado se encontró entre la morfoespecie 2 de Aspergillus sp. y las morfoespecies 5 y 6 de Fusarium sp., corroborando así los resultados obtenidos en las pruebas biológicas. Lo contrario sucedió con las morfoespecies 1, 3 y 5 de Fusarium sp. enfrentadas con la morfoespecie 1 de Aspergillus sp. y las morfoespecies 1,2 3 y 4 de Fusarium sp. enfrentadas con la morfoespecie 2 de Aspergillus sp., aunque estos tratamientos mostraron presencia de actividad antagónica en las pruebas biológicas.

El comportamiento estadístico entre los tratamientos de Nigrospora sp. y Fusarium sp. no presentó diferencias significativas en la actividad antagónica entre los organismos, pero en las pruebas biológicas se observó un alto nivel de competencia al detener su crecimiento las morfoespecies de Fusarium sp. en presencia de las cepas de Nigrospora sp. También se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el tratamiento de Drechslera sp. y la morfoespecie 1 de Fusarium sp.
Los resultados obtenidos en las pruebas biológicas con los tratamientos donde se empleó Papulospora sp.

mostraron la presencia de actividad antagónica por competencia de espacio. También se observó claramente la ventaja de Papulospora sp. sobre Fusarium sp., demostrando así el potencial como organismo antagóni
co para ejercer un posible control biológico. En la actualidad son pocos los estudios realizados sobre este hongo, por lo que resulta interesante observar su comportamiento frente a organismos patógenos como Fusarium oxysporum.

Los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo de las dos morfoespecies de Nigrospora sp. y las seis de Fusarium sp. demuestran su potencial como controlador biológico de otros fitopatógenos.

4. CONCLUSIONES

Las morfoespecies de Trichoderma evaluadas presentaron gran capacidad antagónica frente a las morfoespecies de Fusarium sp. por su rápido desarrollo y su capacidad para ejercer una competencia eficaz por el espacio al inhibir el crecimiento de Fusarium sp.
Las pruebas biológicas de los hongos del género Nigrospora sp. mostraron presencia de actividad antagónica. Hongos del género Nigrospora sp., que han sido reconocidos como agentes antagonistas de Alternaria solani (Mónaco, 1997), indican evidencias de su potencial como antagonista de Fusarium sp.Se confirmó que Alternaria sp. es un reconocido antagonista de Fusarium sp.

Las morfoespecies de Aspergillus sp. mostraron diferencias biológicamente manifiestas en el desarrollo de los organismos enfrentados, demostrando la presencia de actividad antagónica efectiva contra las diferentes morfoespecies de Fusarium sp.

Se presentó actividad antagónica en los diferentes tratamientos con los hongos aislados del follaje de heliconias, indicando que estos no solo están ejerciendo una actividad patógena en los cultivos, sino que también están contrarrestando, de alguna forma, la severidad del ataque de otros fitopatógenos más agresivos.

Se destaca que los cultivares de heliconias presentan una gran cantidad de microorganismos asociados, algunos de los cuales están ejerciendo un papel antagónico contra patógenos naturales de estas plantas. El estudio realizado por Martínez (2008) encontró que el cultivo, aunque tenía una abundancia de ciertos organismos causales de enfermedad, no se encontraba totalmente abatido. Las pruebas de antagonismo realizadas con hongos aislados del follaje parecen indicar que existen especies capaces de controlar las diferentes morfoespecies de Fusarium sp., mostrando una mayor eficiencia de las dos morfoespecies de Trichoderma sp.

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 

Agrios, G. N. (2005). Fitopatología. Segunda edición. México. Editorial Limusa, 838p.

Armstrong, G. M. and Armstrong, J. K. (1981). Formae speciales and races of Fusarium oxysporum causing wilt diseases. Nelson, P.R., Toussoun, T. A. y Cook, R.J Ediciones. Fusarium: Diseases, Biology and Taxonomy Pennsylvania State University press, 391-399p.

Barnett, H. and Hunter, B. (1972). Illustrated genera of imperfect fungi. Tercera Edición Estados Unidos. Burgess Publish Company, 225p.

Benítez, T., Rincón, A. M. and Codón, A. (2004). Biocontrol mechanisms of Trichoderma straits. International microbiology, 7: 249-260.

Betancourt, J. y Krees, W. (1993). Distribución natural de las heliconias de Colombia. Memorias del primer seminario nacional de heliconias y plantas afines. Manizales, 50p.

Borrero, C. y Silva. H. (2005). Efectos de Trichoderma (in vitro) en los microorganismos no patógenos descomponedores de la materia orgánica de un suelo oxisol clase IV del piedemonte llanero. Revista Orinoquía, 9 (2):6-14.

Cárdenas, A. (1999). Control biológico bajo condiciones de invernadero de Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici saccardo en tomate Lycopersicon esculetum Mill empleando pregerminación controlada de semillas y los agentes bio-controladores Trichoderma koningii Oudemans y Pseudomonas fluorescens Migula. Trabajo de grado. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá. 53p.

Cole, J. S. and Zyenyika, Z. (1988). Integrated control of Rhizoctonia solani and Fusarium solani in tobacco transplants with Trichoderma harzianum and triadimenol. Plant Pathology, 37: 271-277

Correa, M., y Peñuela. A. (2002). Aspectos de la biología de un hongo del género Rhizoctonia y de su interacción in vitro con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Acta Biológica Colombiana, 7 (1):41-52.

Cotes, A. (1993). Study of common bean protection against damping-off by treatment of seeds with Trichoderma koningii Oudemans. Tesis de Doctorado. Gembloux, Facultad de Ciencias Agronómicas. élgica, 120p.

Escalona, F., Maciel, N. y Renaud, J. (1992). Un manchado de las inflorescencias de heliconias. Trabajo de grado. Escuela de Agronomía, Universidad Centro Occidental Lisandro Alvarado. Barquisimeto, 182p.

Hammer, O., Harper, D. A. and Ryan, P. D. (2001). Past: Paleontological Statics software package for education and analysis. Paleontología Electrónica, 4(1): 1-9.

Harman, G. E., Latorre, B., Agosin, E., Martin, R.S., Riegel, D. G., NIelsen, P. A., Tronsmo, A. and Peterson, R. C. (1996). Biological and integrated control of Botrytis bunch rot of grape using Trichoderma sp. Biological Control, 7:259-266.

Hermosa, M. R., Grondona, I., Iturriaga, E. A., Díaz-Minguez, J. M., Castro, C., Monte, E. and Garcia-Acha, I. (2000). Molecular characterizacion and identificación of biocontrol isolates of Trichoderma sp. Applied and Environmental Microbiology, 66 (5): 1890-1898.

Kress, W., Betancur, J., Roesel, C. y Echeverry, B. (1993). Lista preliminar de las Heliconias de Colombia y cinco especies nuevas. Caldasia, 17(82): 183-197.

Madriz, R., Smith, G. y Noguera, R. (1991). Principales hongos patógenos que afectan algunas especies del género Heliconia. Agronomía Tropical, 41(5-6): 265-274.

Martínez, E. (2008). Caracterización y diagnóstico de hongos fitopatógenos presentes en cultivares de la familia Heliconaceae en el Parque Nacional de las Heliconias Caicedonia – Valle. Tesis de pregrado. Cali, Colombia. Universidad del Valle, Facultad de Ciencias, 75p.

Mónaco, C. (1997). Presencia y frecuencia de la micoflora saprobia del filoplano de tomate y su posible uso para el control biológico de Alternaria solani (Ell & Mart) Jones & Grout. Tesis de Magister. Facultad Ciencias. Agrarias y Forestales (UNLP). La Plata, Buenos Aires, 60p.8. Extraído de: <http://www.proexport.com.co/intelexport/aplicación/frames.asp?origenadmin=impoadmin> consulta: 15 enero 2008.

Saldarriaga, Y. y Pineda, F. (2001). Manual de Micología aplicada. Editorial Universidad de Antioquia. Medellín. Colombia, 97p.

Smith, I. M., Dunez, J., Lelliott, R. A., Phillips, D. H. y Archer, S. A. (1992). Manual de enfermedades de las plantas. Segunda edición. Editorial Mundi-prensa. Madrid. España, 671p.

Trapero, A., Llácer, G. y López, M. M. (2000). Los hongos fitopatógenos. Trapero, A., Bello, A. Ediciones Patología Vegetal. Segunda edición. Editorial Mundi-Prensa. España, 713-738